W 1506 r. przeniósł się do Mediolanu^[n], gdzie został przyjaźnie powitany przez namiestnika. Karol Amboise darzył artystę wielkim podziwem:

Pokochaliśmy go, zanim poznaliśmy osobiście, a teraz, gdy mamy go przy sobie i z doświadczenia możemy mówić o jego rozlicznych talentach, zaprawdę widzimy, że imię Leonarda, choć już słynne dzięki malarstwu, nie otrzymało należnej pochwały z racji wielu innych posiadanych przezeń przebogatych darów[11].

Leonardo był honorowym gościem na zamku. Jednakże w napisanym później liście wysuwał prośbę o kwaterę w mieście, co wskazuje, iż potrzebował odrobiny swobody.

Leonardo nie chciał powrócić do Florencji. 18 lipca Karol Amboise napisał list do Signorii z prośbą o możliwość przedłużenia pobytu Leonarda da Vinci w Mediolanie pod pretekstem ukończenia rozpoczętych dla niego prac nad zbudowaniem letniej willi. Prośbę wsparł oficjalny list wicekanclerza Gefroi Carlesa, który prosił o przedłużenie urlopu artysty o miesiąc i zobowiązywał się, iż powróci on w wyznaczonym terminie. Signoria w liście z 28 sierpnia przystała na warunki, jednakże Leonardo nie wyjechał pod koniec września do Florencji. 9 października gonfalonier Piero Soderini napisał do namiestnika list ze skargą. D'Amboise odpisał dopiero 16 grudnia, przyrzekając, iż nie zatrzyma Leonarda w Mediolanie, przy czym skarcił Soderiniego za nieumiejętność zapewnienia artyście optymalnych warunków dla rozwoju jego talentu. Niebawem ambasador Francesco Pandolfini otrzymał od króla Francji, Ludwika XII, wiadomość, iż zachwycił go obraz Madonna z kądzielą i pragnie, by artysta stworzył dla niego jakieś dzieło. W wysłanym 14 stycznia 1507 r. liście do Signorii jego zachcianka przybrała formę żądania. W odpowiedzi z 22 stycznia władze wyraziły zgodę na pozostanie Leonarda w Mediolanie.

W lutym da Vinci towarzyszył namiestnikowi w czasie zdobywania Baiedo. Tworzył wówczas pierwsze projekty kościoła Santa Maria della Fontana. 20 kwietnia Karol Amboise podarował Leonardowi list do skarbników księstwa, który przywracał mu na własność winnicę, zagarniętą po wkroczeniu wojsk francuskich do Mediolanu w 1500 r. Pod koniec kwietnia do Mediolanu przybył król Ludwik XII. Leonardo przygotował plastyczną oprawę uroczystości jego wjazdu do miasta. Król zachwycony kreatywnością artysty w nagrodę przyznał mu dożywotnio dochody z opłat wnoszonych przez użytkowników Naviglio di San Cristofano, odcinka kanałów miejskich.

Madonna wśród skał – II wersja

Leda klęcząca – studium do Ledy z łabędziem

Latem 1507 roku Ambrogio i Leonardo mieli przystąpić do ukończenia Madonny wśród skał, jednak doszło między nimi do konfliktu na tle podziału wypłaty. Poprosili o rozstrzygnięcie sporu dominikanina Giovanniego de Pagnanis, jednakże do tego czasu doszli do porozumienia i ukończyli obraz, a 26 sierpnia zleceniodawcy wypłacili im połowę honorarium. Odebrał ją Amborgio, gdyż da Vinci przebywał wówczas we Florencji na kolejnym rozstrzygnięciu sporu z przyrodnimi braćmi.

Krótko po tym wydarzeniu Leonardo poznał Francesca Melzi, który stał się początkowo jego uczniem, a następnie kompanem do ostatnich dni jego życia. Następnie artysta wielokrotnie wyjeżdżał do Florencji w celu uregulowania sporów majątkowych z przyrodnimi braćmi. Pierwszy wyjazd miał miejsce w połowie 1507 r. Po śmierci wuja Francesca w sądzie toczył się spór o jego majątek. Prawowici potomkowie ser Piera da Vinci starali się podważyć testament stryja na podstawie naruszonej umowy z ich ojcem. 26 lipca król Francji wysłał list z prośbą o interwencję na korzyść artysty, natomiast 15 sierpnia Charles d' Amboise wysłał list do Florencji z prośbą do władz o przyspieszenie procesu oraz zapowiedzią szybkiego przybycia Leonarda w celu uregulowania sprawy. Rozpatrzeniem sprawy zajął się ser Rafaello Hieronim. 18 lipca da Vinci napisał do Soderiniego, by wymógł od Rafaella zakończenie procesu do 1 listopada, jednakże nie nastąpiło to tak szybko. Leonardo po przybyciu do Florencji z Salaiem zatrzymał się w Palazzo Martelli mecenasa sztuki Piera di Braccia Martellego przy Via Larga. Tam poznał bliżej i zapałał sympatią do Giovanniego Francesca Rusticiego. Owocem ich znajomości była rzeźba grupowa Św. Jan nawracający lewitę i faryzeusza. Od 22 marca w przerwach między rozprawami da Vinci zaczął porządkowanie swoich notatek, jednakże przysporzyło mu to wiele trudności. Ostatecznie Leonardowi przypadł w udziale majątek Il Botro, znajdujący się w odległości 4 mil od Vinci.

Następnie Leonardo przeprowadził się do pracowni przy Via Varga. Wykonywał wówczas zadania artystyczne, ale niewiele wiadomo o jego twórczości z tego okresu. Prowadził nadal prace nad Mona Lisą oraz kontynuował doradzanie Rusticiemu przy pracy nad grupową rzeźbą. Szczodre wynagrodzenia od zleceniodawców umożliwiały mu rozwijanie zainteresowań. Prowadził badania anatomiczne. Wykonywał sekcje zwłok we florenckim szpitalu. Coraz bardziej interesował się tajemnicami ludzkiego ciała, pasjonowała go też geologia. W celach badawczych wiele podróżował.

Przed Wielkanocą wrócił do Mediolanu. Zamieszkał w parafii kościoła Santa Babila przy ulicy Porta Orientale i otworzył tam pracownię. Leonardo dopracowywał wówczas dzieła Święta Anna Samotrzeć i Mona Lisa oraz stworzył obraz Leda z łabędziem, skupił się także na tworzeniu nagrobnego Pomnika konnego Giangiacoma Trivulzia. W międzyczasie oddawał się studiom nad hydrologią, optyką, geometrią, geologią oraz zagadnieniem wzroku. Zajmował się także przygotowywaniem dekoracji na przedstawienia teatralne, festyny i inne widowiska, sporządził również trzy emblematy. Pod koniec 1509 r. Leonardo wyjechał w towarzystwie sześciu uczniów do Pawii na wykłady z anatomii, prowadzone przez Marcationa della Torre. Między badaczami nawiązała się trwała współpraca. Swoje badania anatomiczne opierali na wykonywanych wspólnie sekcjach zwłok. Znajomość przerwała nagła śmierć della Torre w 1511 r.

Tego samego roku 10 marca zmarł protektor artysty, Karol Amboise. Leonardo dalej otrzymywał pensję z królewskiej kasy, ale nie dostawał już hojnych darów od Charlesa. Wówczas artysta wyjechał na pewien czas z miasta w góry w rejonie La Brianza, najprawdopodobniej z zadaniem o charakterze militarnym. 16 grudnia szwajcarscy żołnierze w służbie Świętej Ligi ostrzelali miasteczko Desio. Leonardo utrwalił to wydarzenie na rysunku.

W stoczonej między Francuzami a Świętą Ligą 11 kwietnia 1512 r. bitwie pod Rawenną zginął namiestnik Mediolanu Gaston de Foix. Pomimo zwycięstwa Francuzów, ich władza w Lombardii mocno osłabła, a pod koniec roku Sforzowie znów przejęli władzę w Mediolanie. 29 grudnia Massimiliano Sforza i Cesare^[o] wjechali tryumfalnie do miasta. Leonardo uciekł z Mediolanu. Większość tego okresu spędził w Villa Melzi, wiejskim domu Girolama Melziego^[p] w pobliżu wsi Vaprio d'Adda. Wówczas Leonardo poświęcił się studiowaniu hydrologii i anatomii, zajął się także upiększeniem domu. Nie odnalazł tam upragnionego spokoju, gdyż 5 stycznia 1513 położony kilka kilometrów dalej zamek z Trezzo został ostrzelany przez Wenecjan. Leonardo sporządził rysunek tego zdarzenia.

Na początku 1513 r. Leonardo przybył do Mediolanu, gdzie zamieszkał u Prevostina Violi. Latem artysta otrzymał zaproszenie do Rzymu i ofertę ponownej współpracy z rodem Medicich^[q]. 24 września artysta wyjechał z Mediolanu wraz z pięcioma uczniami. Wyruszyli na południowy wschód drogą Via Emilia – przez Lodi, Piacenzę, Parmę, Regio Emilia, Modenę i Bolonię i skierowali się na południe, podróżując przez Apeniny. Zatrzymali się na krótko we Florencji, Leonardo odwiedził wówczas Alessandra Amadoriego^[r].