W pierwszym wydaniu Żywotów najsławniejszych malarzy, rzeźbiarzy i architektów Giorgio Vasari pisał:

Leonardo miał umysł o nastawieniu tak heretyckim, że nie zgadzał się z żadną religią, będąc znacznie bardziej filozofem niż chrześcijaninem[12].

Nie ma jednak pewności, czy Vasari nie pisał tych słów pod naciskiem kościelnych autorytetów. Rzetelność biografii jest także niepewna, gdyż powstała ona w 1550 r., czyli zaledwie 30 lat po śmierci artysty.

Wiadomym jest, że Leonardo przez całe życie podważał dogmaty i odnosił się sceptycznie do dosłownej interpretacji Biblii. Artysta w swoich notatkach kwestionował m.in. biblijne wytłumaczenie potopu, krytykował także wszystko, co uznawał za pustą obrzędowość, uważając, że wszystkie bezmyślne ceremonie są tematem do żartów. Oburzała go też praktyka sprzedaży odpustów. Nadawał miano faryzeuszy świętym braciszkom, którzy propagowali takie posunięcia. Był przeciwny nadmiarowi władzy, jaką dysponował Kościół. Sprzeciwiał się również masowemu handlowi rzekomo świętymi relikwiami.

Leonardo uważał, iż nie znajdziemy duchowości w formalnych ceremoniach, relikwiach, dogmatach, czy dosłownej interpretacji słów Biblii. Jego duchowość znajdowała swoje źródło w percepcji, świadomości i doświadczeniu, które propagował, by wzbogacić swoje malarstwo. Uważał, że świat ożywia boska obecność. Rozumiejąc, iż Bóg stworzył ludzi na swoje podobieństwo, zajmował się portretowaniem w swoich obrazach tego, co jest podobne do Stwórcy. Uznawał, że przez swoją twórczość malarską osiąga jedność z myślą Stwórcy. Religijny duch Leonarda był widoczny w symbolice i przedstawieniach na jego obrazach. Uważał, że boskość ujawnia się w przyrodzie i powinno się ją czcić na drodze jej dogłębnych studiów i uznania dla jej doskonałości.

W swoich notatkach Leonardo przedstawiał pogląd, że istnieje jeden boski umysł, który całym sobą ogarnia wszechświat. Podkreślał, iż wszystko, co zostało stworzone, jest ze sobą powiązane, a wszechświat jest owocem bożej miłości.

Przy okazji prowadzenia sekcji zwłok, Leonardo poruszał kwestię duszy nienarodzonego dziecka. Twierdził, że płód jest istotą całkowicie zależną od duszy i ciała matki:

Jedna dusza rządzi oboma ciałami, dzieląc swoje pragnienia, obawy i smutki z tą istotą i ogółem zwierzęcych organów[13].

Artysta uważał, że by dusza miała swobodę, musi mieszkać w jakimś ciele.

Najlepiej o jego religijności świadczą jego słowa, zapisane w Manuskrypcie paryskim H:

Dobre uczynki wznoszą się i sięgają Nieba, ponieważ cnota znajduje uznanie w oczach Boga. Złe uczynki natomiast przeciwnie, ponieważ są sprzeczne z wolą Boga – strącane są w otchłanie piekła. ...O ty, który podziwiasz naszą cielesną powłokę – nie bądź smutny, że wraz z innymi dosięgnie ciebie śmierć, lecz raduj się, że nasz Stwórca obdarzył nas tak wyjątkowym narzędziem jak intelekt.